博莱霉素诱导肺纤维化小鼠模型的建立及特征

                                             博莱霉素诱导肺纤维化小鼠模型的建立及特征
                           赵永强，楚海燕，膝礼，吴文育，刘庆梅，伍婷，马彦云，邹和建，王久存，郭刚

    基金项目:国家自然科学基金面上项目(No.81270120);上海市“科技创新行动计划”基础研究重点科技项目(No.lOJC1402100)作者单位:063000唐山，河北联合大学中医学院中医内科学专业(赵永强);200433上海，复旦大学生命科学学院现代人类学教育部重点实验室(楚海燕、刘庆梅、伍婷、马彦云、王久存);310058杭州，浙江大学医学部病理与病理生理学系‘滕礼);200040上海，复旦大学附属华山医院皮肤科(吴文育);200040上海，复旦大学附属华山医院风湿科(邹和建);050091石家庄，河北以岭医院风湿免疫科(郭刚)
通讯作者:郭刚，E-mail : chenxiangmahuang@ 163. com
    【摘要】目的探讨博莱霉素气管灌注诱导肺纤维化小鼠模型在不同时期分子生物学及组织病理学的改变。方法6一8周龄C57 BL.}6小鼠60只，30只为正常对照组，30只以博莱霉素2. 5 mg/kg单次气管灌注建立小鼠肺纤维化模型(模型组)，以肺组织病理学形态及基因表达水平为指标，判断模型小鼠肺纤维化发展阶段。结果正常对照组小鼠的肺组织无明显病理改变，模型组小鼠肺部有不同程度的肺泡结构破坏、炎性细胞浸润以及大量以胶原为主的细胞外基质沉积。基因表达检测结果显示:模型组灌注博莱霉素I一2周，小鼠肺组织白介素(IL ) -4 , IL-I3较正常对照组升高，而3一5周模型组与正常对照组无差异(P>0.05)。模型组肺组织中胶原基因Coll a2 , Cola13、结缔组织生长因子(CTGF)、转化生长因子书:( TGF-}i,)均较正常对照组有不同程度的升高，与组织病理学改变一致。结论博莱霉素2. 5 m岁kg单次气管灌注可成功建立肺纤维化小鼠模型;博莱霉素灌注早期以肺部炎性浸润为主，第3周时肺纤维化达到高峰，第5周开始纤维化有所缓解。
    【关键词1肺纤维化;动物模型;博莱霉素;纤维化期;小鼠
    【DOI}   10.3969/j. issn. 1671-6450.2013.09.017

    肺纤维化(pulmonary fibrosis , PF )是以肺组织反复破坏、修复，最终造成肺组织中形成大量以胶原为主的细胞外基质(ex-tracellular matrix, ECM )沉积为病理特点的一类疾病，是各种肺部疾病的共同结局。肺纤维化的过程包括肺泡持续性损伤、成纤维细胞(fibroblast, FB)活化增殖，最终导致大量的ECM沉积川。肺纤维化严重威胁人类健康，但其确切发病机制至今尚未完全明了，仍缺乏特异有效的治疗手段，因此对肺纤维化发病机制的研究对临床治疗具有指导意义。博莱霉素是一种抗肿瘤药物，其常见的不良反应是导致肺间质纤维化。现通过建立肺纤维化小鼠模型，明确各时期小鼠肺组织病理改变及代表性细胞外基质(ECM)基因表达的变化，并与人类肺纤维化发展不同阶段指标变化相关联，可指导不同阶段的临床研究与用药，为开发新的药物或其他治疗措施提供可靠依据。
1材料与方法
1. 1材料动物:健康C57BL/6小鼠6-8周龄，雌性，体质量17一20 g，由上海西普尔一必凯实验动物有限公司提供。动物分笼饲养，自由饮水，室温(20土2)}C,湿度55% } 60%。试剂:博莱霉素购自日本化药株式会社，RNAlater购自美国Ambion公司，Sircol assay购自英国Biocolor公司，TRI Reagent和胃蛋白酶( Pepsin , from porcine gastric mucosa)购自美国SIGMA公司。
1.2实验方法
1.2.1模型制备:60只小鼠随机分成2组，即模型组和正常对照组。采用单次气管灌注给药法建立肺纤维化小鼠模型，无菌操作。模型组给予气管灌注博莱霉素(2. 5 m岁kg)，根据体质量计算出博莱霉素量，用生理盐水补足至50闪进行气管灌注，正常对照组给予50闪生理盐水气管灌注。造模前以3%水合氯醛溶液0.巧ml腹腔注射进行麻醉，造模完成后常规饲养。1.2.2标本采取:分别于造模结束后1,2 ,3 ,4 ,5周处死小鼠。眼球取血处死小鼠，采血结束后立即打开胸腔，取出肺组织，分别用于组织病理学检测、胶原测定及RNA抽提。
1.3观测项目
1.3.1组织病理学检测:福尔马林液固定肺组织，常规取材，脱水，石蜡包埋，制片(4p,m) ,HE染色(观察肺组织的炎性细胞浸润以及纤维化发生情况)、Masson染色(观察主要ECM成分胶原蛋白的沉积状况从而反映纤维化的程度)，观察博莱霉素气管灌注后不同时期肺组织炎性反应和纤维化情况，分析肺组织纤维化程度。
1.3.2胶原含量检测:称取冻存的肺组织10 mg，用含1 mg胃蛋白酶的0. 5 mol/L乙酸500闪，消化，置4℃过夜，12 000 g离心10 min后取上清胶原溶液。Sircol assay法检测胶原含量。
1.3.3基因表达检测:TRI Reagent裂解组织，抽提RNA,测定RNA浓度后，RNA 500 ng逆转录成cDNA。实时定量PCR检测Coll a2 , Co13 al ,TGF-(3, , CTGF ,ILK ,IL-13等基因的表达水平并以Gapdh为内参进行标准化。
1.4统计学方法采用SPSS 16. 0软件进行分析。对计量资料行双因素多水平设计方差分析，处理因素间两两比较采用最小显著差(LSD)法。P<0. OS为差异有统计学意义。
2结果
2. 1不同时期纤维化小鼠肺部组织病理学改变正常对照组小鼠肺组织的肺泡腔清晰可见，未见炎性细胞浸润。模型组1周组小鼠肺组织HE染色示小鼠肺组织结构紊乱，可见肺泡腔塌陷、肺间质见灶性单核细胞浸润;Masson染色可见有少量胶原沉积，且胶原主要沉积在血管与气管周围，肺间质仅见少量胶原沉积。2周时小鼠肺组织HE染色显示模型组小鼠肺组织结构紊乱明显，仍有肺泡腔塌陷及炎性细胞的润;Masson染色显示模型组小鼠胶原主要存在于血管、气管与肺泡壁周围，但是程度较弱。3周时小鼠肺组织HE染色示肺泡结构紊乱，但较1及2周时有好转，有肺实质的片状融合，炎性反应较弱;Masson染色可见肺实质形成广泛纤维化，肺泡壁增厚。4周时HE染色肺泡结构仍紊乱，有肺实质的片状融合，但有逐渐好转趋势;Masson染色显示纤维化程度与3周时相比无明显差异。5周时小鼠肺组织结构破坏程度较3 ,4周时减轻;Masson染色显示纤维化程度明显较3 ,4周时减轻。与正常对照组小鼠相比，1周时小鼠炎性反应严重，而3周时纤维化程度最明显，2周时炎性反应与纤维化同时存在，炎性反应程度较1周组轻，纤维化程度较3周组轻。图1见插页IIo

2. 2不同时期纤维化小鼠肺组织中胶原含量变化Sircol as-say检测胶原浓度，酶标仪测定吸收光值，制作标准曲线，根据标准曲线计算出各样本的胶原浓度。检测结果显示:模型组小鼠肺组织的胶原含量均较正常对照组增高，其中第I ,2周胶原含量逐渐升高，分别约为对照组的1.4和I.5倍，第3周胶原含量最高，约为正常对照组的2. 5倍，第4 ,5周胶原含量较第3周逐渐减少，但仍较正常对照组升高，约为正常对照组的1.5倍。
见图20
2. 3不同时期小鼠肺组织炎性因子及ECM基因的表达变化1周时，模型组小鼠肺组织IL-4与IL-13表达均较对照组升高，分别为对照组的I.s与1. 5倍，第2周表达量与第1周相当(P>0. 05 )，后3周与对照组无差异(P>0.05);1周时，模型组Col l a2的表达量升高，约为对照组的1.6倍，第2周表达量与第1周相似，第3周达高峰，约为对照组的3倍，4周时表达约为对照组的1. 5倍，5周时表达量与对照组无差别(尸>0.05) oCo13a1在小鼠肺组织中的表达变化趋势与Col l a2基本一致。I周时，小鼠肺组织Co13a1的表达量升高，约为对照组的1.4倍，第3周达高峰，约为对照组的1.6倍，第4周时表达量相当于第1,5周时表达量，与对照组无差别(P>0.05)0TGF-p:的表达量在第1周时模型组与对照组无明显差异(P>0.05)，第2周时表达量约为对照组的1.5倍，并且逐渐增高。第3周时达到峰值，约为对照组的1.7倍，第4 ,5周时表达量与对照组无差异(P>0. 05 ) o CTGF在不同时期的表达量均高于对照组，且在第3周时的表达量最高约为对照组的2倍。第5周时的表达量仍居高不下。见图3

3讨论
    博莱霉素诱导的肺纤维化模型是公认的较成熟的模型，可以反映人类肺纤维化的病理特点[[2,3]。迄今，已有大量肺纤维化模型相关的文献报道，但是各研究团队在模型的建立上有较大差异，造模时给药途径也有多种，包括静脉给药、气管灌注、雾化吸人、腹腔注射及鼻腔吸人，而以气管灌注法较常用[f9]0灌注博莱霉素的剂量在各实验间也存在较大差异，文献报道中最小剂量为0.02 mg/kg[5]，最大剂量为10 mg/kg[6}。有文献报道，小剂量(2 m岁kg)的博莱霉素气管灌注可建立肺纤维化模型，病死率相对较低，但各模型鼠存在较大差异，存活的6只小鼠中有3只未见肺部明显异常，即造模成功率较低;大剂量(5m岁kg)的博莱霉素气管灌注小鼠病死率明显增高，灌注博莱霉素后28 d 15只小鼠仅存活1只t}l。同时，博莱霉素诱导的肺纤维化动物模型在纤维化发展进程中的分子生物学指标变化还不是很清晰。
    纤维化疾病以细胞外基质沉积为主要特点，胶原是细胞外基质的主要组成成分，尤其是I型和m型胶原〔s]。一般认为纤维化疾病的发展包括炎性反应和纤维化2个阶段，已有研究表明IL-4 ,IL-13在纤维化疾病发展过程的炎症阶段发挥重要作用!9J。肺组织中过量表达IL-13的转基因小鼠可发展至肺纤维化!。III和I1-13可以刺激肺成纤维细胞转化为炎症过程的效应细胞〔”;。张晓哗等匹iz)研究发现IL-4.对于成纤维细胞的增殖、分化及表型转化起关键的调节作用，认为ILK在肺间质纤维化形成早期的表达增高，对于促进纤维化的形成起重要作用。TGF-(3是公认的促纤维化因子，一方面可以促进成纤维细胞增殖并激活肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞;另一方面可以在转录或转录后水平调节胶原蛋白等ECM基因表达并且可以抑制ECM的降解[”〕。在哺乳动物中TGF-p包括3个异构型，即TGF-a, , TGF-(32 , TGF-(33，其中TGF-(3:在调节肺纤维化的发生中发挥关键的作用，在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中其基因及蛋白表达均升高，在特发性肺纤维化患者肺中也上调表达}'a} o CTGF是一种富含半胧氨酸的多肤，是纤维化发
生过程中的一个重要细胞因子，由平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞合成与分泌，被认为是TGF-(3，下游的一个关键的促纤维化因子，CTGF基因的启动子上有TGF-p的调控原件，TGF-日则是CTGF表达的最直接、最强健的刺激因子}'S} o TGF-(3可以激活成纤维细胞中的CTGF，活化的CTGF刺激DNA的合成从而促进ECM基因的表达，进而诱导纤维化的发生。因此，CTGF在肺组织中高表达可促进纤维化的发生!n}综上所述.在博莱霉素灌注后的不同时期检测炎性基因IL.},IL-13及胶原基因和蛋白以及TGF-pCTGF基因的表达水平可以评价小鼠肺纤维化的程度。
    本研究以博莱霉素2. 5 m酬吨气管灌注小鼠建立肺纤维化模型，灌注博莱霉素后1周时，小鼠肺组织出现病理变化:以炎性细胞浸润为主，尤其在血管及气管周围，肺实质出现多发片状改变;此外，炎性因子ILK及IL-13较正常对照组升高，胶原基因Goll a2,Co13a1和TGF-(3，较正常对照组也有所升高，同时在血管与气管周围伴有少量胶原沉积，说明此期小鼠肺组织以炎性反应为主。而灌注博莱霉素2周时，组织病理检测显示小鼠肺组织仍存在炎性反应，但较灌注博莱霉素1周时炎性反应稍有减轻，同时Il-4及I1-13基因表达量仍较正常对照组高，另一方面，胶原基因和蛋白表达都较正常对照组升高，且有少量胶原沉积，说明此期小鼠肺组织炎性反应较1周时稍减弱，同时开始发生纤维化。促炎因子IL-4及IL-13的基因表达量在灌注博莱霉素3周后与正常对照组均无差异，说明3周后炎性反应较弱。灌注博莱霉素3周时，小鼠肺实质广泛纤维化为主，但炎性反应较弱;此外，Colla2 ,Co13a1,TGF-(31及CTGF的表达均较正常对照组明显升高，尤其是Coll a2基因表达约为正常对照组的3倍，升高显著，说明此期小鼠肺组织纤维化程度明显，炎症反应较弱。而灌注博莱霉素4周时，组织病理学与3周组无明显变化，但是基因及胶原蛋白表达水平均较3周时降低，说明此期小鼠肺组织纤维化程度仍明显。灌注博莱霉素5周时，组织病理学显示小鼠肺组织中胶原的沉积较3周和4周组明显减少，同时Coll a2 ,TGF-(3,基因表达较正常对照组无明显变化，Co13a1,CTGF的表达较正常对照组稍升高，说明此期小鼠肺组织纤维化程度有缓解。
    上述结果表明，博莱霉素灌注1周后小鼠肺组织以炎性反应为主，之后开始发生纤维化，随后炎性反应逐渐减弱，促纤基因表达升高，胶原合成增加，纤维化程度随之加重，3周时纤维化程度达到高峰，基因及胶原蛋白表达水平均显著升高，表明肺纤维化模型已成功建立。4周时组织病理学改变虽不明显，但基因表达有所降低，至5周时基因表达接近正常水平，组织病理学仍显示有轻微纤维化发生。推断可能是由于模型的自限性而引起纤维化自发缓解。有文献报道，通过博莱霉素气管灌注后1周肺组织达到炎性反应的高峰，3周时纤维化程度最明显〔’吕]，本实验结果与该文献报道结果一致。自发缓解发生时，基因表达水平首先发生改变，进而调控细胞外基质的合成与降解，因此会出现基因表达水平与病理学改变的不同步性。
    综上，给予小鼠单次2. 5 mg/kg博莱霉素气管灌注可成功建立肺纤维化小鼠模型。各项分子生物学及病理组织学指标可反映小鼠肺组织改变从炎性反应发展到纤维化的过程。但模型到后期有自我缓解的趋势，与人肺纤维化疾病的不可逆性仍存在差别，是今后纤维化研究中需要解决的课题。该研究提供了博莱霉素诱导肺纤维化发展的精细过程，在一定程度上反映人类肺纤维化发生发展的进程，为探索人类肺纤维化的发生及治疗提供理论基础，同时为研究药物干预治疗的用药时间提供理论指导，有助于对纤维化疾病发生发展的理解及抗纤维化新药的开发。